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2019-10-19 00:03 来源:大河网

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颜骏  
【摘要】:目的脓毒症是一种医院重症监护病房常见的疾病,其发病率已经达到每10万人437例,并在过去的十年发病率增长超过一倍。同时脓毒症的治疗花费高昂,2011年美国脓毒症治疗费用超过200亿美元,占当年医院总费用的5.2%。目前研究认为脓毒症源于宿主对感染的过度应答反应,其特点为之一为高死亡率。心脏是易受脓毒症影响的重要器官之一,心肌功能障碍对脓毒症诱导的多器官功能障碍的发生和脓毒症患者的高死亡率中起着重要作用。然而迄今为止,引起脓毒症心肌功能障碍发生的潜在机制尚不完全清楚。炎症小体是一种存在于细胞胞质内的蛋白复合物,其作为半胱天冬酶(caspase)-1成熟和活化的平台,可诱导下游的白介素(IL)-1β和白介素-18的成熟和分泌。炎症小体可被细胞内的传感器蛋白激活,这些传感器蛋白可以接受多种炎症刺激的作用,包括病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子模式(DAMPs)。Nod样受体(NLR)家族(NLRP1,NLRP3和NLRP4)和AIM2是炎症小体的传感器蛋白,其中NLRP3是一种独特的传感器蛋白,可响应多种物理和化学刺激,以及细胞应激信号,如活性氧(Reactive oxygen species,ROS),细胞外的三磷酸腺苷(ATP)等。目前研究表明,NLRP3炎症小体的激活存在双信号通路。第一信号(引发)由微生物或内源分子提供,其通过激活NF-κB诱导NLRP3和pro-IL-1β生成;第二信号(激活)则是由ATP、颗粒物质、病毒RNA、成孔毒素等多种物质触发。炎症小体激活后将procaspase-1蛋白水解切割成有活性caspase-1,后者将细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18分别转化为成熟有生物活性的IL-1β和IL-18。在心肌组织,NLRP3主要表达于心肌成纤维细胞及心脏内皮细胞中,而心肌细胞的NLRP3蛋白水平则有限。我们先前有研究提示,心肌成纤维细胞(CF)的NLRP3炎症小体激活可引起脓毒症诱导的心肌功能障碍。心肌成纤维细胞释放成熟的IL-1β,并通过心肌成纤维细胞和心肌细胞之间的交互作用,可引起心肌的收缩力下降。然而在脓毒症中,心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体的激活机制仍需要进一步研究。本研究我们旨在评估线粒体产生的活性氧(mtROS)对脓毒症心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体激活的作用。方法由3-4周龄的小鼠的心脏中分离出心肌成纤维细胞进行培养。将培养的心肌成纤维细胞用脂多糖(LPS)(1 ng/mL)刺激6小时以进行引发(priming),然后用三磷酸腺苷(ATP)(3 mmol/L)处理0.5小时以激活(activation)。一些已由LPS引发过的心肌成纤维细胞在进一步使用ATP激活前的30分钟加用mito-TEMPO(25μmol/L)进行预处理。然后我们通过线粒体碎片计数来探查线粒体动态变化,使用MitoSOX试剂来检测心肌成纤维细胞的线粒体活性氧水平。用蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测细胞内NLRP3,半胱天冬酶-1和凋亡相关的斑点样蛋白(ASC)等蛋白,并通过酶联免疫吸附法(ELISA)测定检测细胞分泌的IL-1β。通过免疫共沉淀法(Co-immunoprecipitation)测定NLRP3和ASC蛋白之间的相互作用。结果LPS和ATP刺激心肌成纤维细胞后,线粒体碎片数量增加(p0.05)和细胞内线粒体活性氧生成增加(p0.05);加用Mito-TEMPO后,可使心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体激活阶段线粒体活性氧含量下降(p0.05),从而减少NLRP3和ASC蛋白之间的连接,抑制NLRP3炎症小体的激活,进一步减少IL-1β的产生(p0.05)。结论1、LPS和ATP刺激心肌成纤维细胞可引起线粒体碎裂化增加和线粒体活性氧产生的增加。2、线粒体活性氧产生增加可促进NLRP3和ASC蛋白之间的相互作用,从而可激活心肌成纤维细胞的NLRP3炎症小体。3、心肌成纤维细胞NLRP3炎症小体的激活阶段清除线粒体活性氧可抑制炎症小体的激活和IL-1β的产生。综上所诉,我们的试验结果表明:脓毒症可引起心肌成纤维细胞的线粒体碎裂化增加并导致线粒体活性氧产生增多。线粒体活性氧进一步促进NLRP3-ASC蛋白相互作用进而激活NLRP3炎症小体并增加心肌成纤维细胞产生IL-1β。
【学位授予单位】:江苏大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R459.7;R542.2
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